XunB Services
勋博服务
传统技术
细胞培养技术：巨噬细胞与其它细胞、类器官共培养。
流式细胞术：通过CD68、CD163等表面标志区分亚群，分析极化状态。
免疫组化及免疫荧光技术：定位胞内蛋白（如iNOS、Arg1）检测细胞因子分泌。
WB技术：检测巨噬细胞相关蛋白表达。
ELISA技术：检测外周血、其它体液、或者组织匀浆中细胞因子分泌。
流式分选或免疫磁性细胞分离：用于分离特定类型的巨噬细胞。
实时定量PCR（RT-qPCR）：提供可靠的数据，用于分析基因表达水平。
前沿技术
单细胞RNA测序
揭示巨噬细胞在肿瘤、感染等微环境中的转录异质性
空间转录组学
结合组织定位信息，解析巨噬细胞与邻近细胞的相互作用
超分辨显微镜（SRM）
3D-STORM技术解析吞噬过程中足突与微管骨架的动态连接
光遗传学调控
蓝光激活TLR受体，精准操控巨噬细胞信号通路
蛋白质组学技术
用于全面分析蛋白质表达
巨噬细胞分型与功能研究方法
- 免疫学标记与流式细胞术：利用抗体标记表面抗原，如CD68、CD163等，区分M1型和M2型巨噬细胞。
- 诱导分化实验：通过LPS、IFN-γ等诱导巨噬细胞极化为M1型或M2型。
- 共培养技术：研究巨噬细胞与其他细胞（如间充质干细胞）的相互作用。
巨噬细胞培养与提取方法
- 原代巨噬细胞提取：通过密度梯度离心、磁珠分选等方法分离单核细胞并分化为巨噬细胞。
- 细胞培养技术：包括培养基选择、传代、换液等操作，用于维持巨噬细胞的活性。
功能研究模型
- 极化诱导：LPS+IFN-γ（M1）或IL-4+IL-13（M2）体外刺激。
- 基因编辑：CRISPR敲除关键基因（如IRF5、STAT6）研究极化调控。
勋博标准化实验服务
XunBio Standardized Experimental Services
获取需求与方案设计
制定操作规程（SOP）
实验准备
实验操作
数据处理
与分析
结果复核
与报告
交付标准
获取需求与方案设计
明确科研用户需求，包括实验样品类型、实验参数及技术标准等。
然后，根据需求设计实验方案，并与科研用户确认后签订合同。
- 课题方案设计及修改
- 实验方案设计及修改
- 根据实验预算进行方案可行性调整
- 确认最终实验方案
- 签订《实验服务合同》
制定操作规程（SOP）
实验前勋博生物会制定详细的操作规程，涵盖实验步骤、所需仪器、试剂、条件等内容，确保所有实验人员能够按照统一标准进行操作。
实验准备
包括试剂准备、设备校准、样品处理等。实验前需对所有物资进行测试准备，并完成预实验以验证实验方案的可行性。
实验操作
按照标准化操作规程进行实验，包括实验条件的控制（如温度、湿度等），并记录实验数据。实验过程中需严格遵守操作规范，减少人为误差
数据处理与分析
实验完成后，对数据进行清洗、统计分析和结果判断。数据处理需遵循统一的标准，以确保结果的准确性和可比性
结果复核与报告
实验结果需经过复核确认无误后，形成标准化的检测报告。报告内容应包括实验原理、方法学性能、质控要求及临床意义等
获取需求与方案设计
- 动物造模实验记录及实验报告
- 动物实验结果及实验报告
- 细胞培养照片及实验报告
- 巨噬细胞与类器官共培养实验报告
- 病理染色染色照片及实验报告
- RT-qPCR实验数据及实验报告
- 蛋白印迹（WB）实验数据及实验报告
- ELISA实验数据及实验报告
- 免疫组化（IHC）染色照片及实验报告
- 免疫荧光（IF）染色照片及实验报告
- 流式细胞术（FCM）实验数据及实验报告
- 单细胞测序实验报告
- 空间转录组测序实验报告
- 多重荧光（TSA）染色照片及实验报告
- 基因编辑实验报告
- 蛋白质组学实验报告
- ……
Disease models
xx模型
脑卒中模型
脑卒中（cerebral stroke）又称“中风”是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性和出血性卒中。缺血性卒中的发病率高于出血性卒中，占脑卒中总数的60%-70%。脑卒中已成为我国第一位死亡原因，也是中国成年人残疾的首要原因。
脑损伤模型
脑损伤（brain injury，BI）或脑部受伤（brain damage）是指脑细胞的受损或是退化。脑损伤可能因为内在或是外在因素所造成。一般而言，会用“脑损伤”来表达一般明显的，因为脑部受创造成的损伤；而用神经毒性表示选择性的，因为化学物质引起的脑部损伤。
疼痛模型
疼痛(pain)是临床上最常见的症状之一。包括伤害性刺激作用于机体所引起的痛感觉，以及机体对伤害性刺激的反应（躯体运动性反应和/或内脏植物性反应，常伴随有强烈的情绪色彩）等多维度现象。痛觉可作为机体受到伤害的一种警告，引起机体一系列防御性保护反应。
阿尔兹海默症模型
阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease）简称AD，俗称老年痴呆，是一种过程缓慢且不可逆的，以记忆功能和认知功能退化为特征的临床综合症，多发于老年期。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。
癫痫模型
癫痫（Epilepsy）又称脑痫症，是一种神经性疾患，特征为反复地癫痫发作，即为重复发作或长或短的严重抽搐症状，可能会造成物理性伤害，甚至骨折。患者倾向在无诱发原因下持续重复地发作。
抑郁症疾病模型
抑郁症是一种常见的精神障碍，广泛存在于各个年龄段中，其主要症状是情绪低落、思维迟缓、意志活动减退、兴趣和愉悦感丧失。此外，还会出现各种附加的症状，如睡眠障碍，消化系统疾病和其他身体问题，严重的甚至会出现自杀倾向。
精神分裂疾病模型
精神分裂症是一种多呈缓慢性或亚急性发生的复杂的精神疾病，病情及症状多样化。精神分裂症以精神活动和环境不协调为特征，不仅影响脑神经的高级思维功能，而且能够促使患者在感觉、知觉、思维活动、日常行为活动、情感等方面发生障碍。
脑膜炎模型
（meningitis）是脑脊膜炎的简称，指发生于脑脊膜的急性或慢性炎症，脑膜与脊膜常同时发炎。脑脊膜是包裹大脑和脊髓的保护薄膜，包裹脑的部分称为脑膜，包裹脊髓的部分称为脊膜。
勋博技术优势
三维建模能力”支撑全链条解决方案：
🔹 深度维度：突破单一尺度限制（如精神分裂症模型同步模拟D2受体过表达与皮层-边缘系统信息流紊乱）
🔹 时间维度：实现疾病进展推演（癫痫模型重现海马硬化从Latent Period到Chronic Phase的转化）
🔹 空间维度：解剖结构精准映射（脑膜炎模型量化炎症因子在脑池、基底池的扩散梯度）
勋博技术通过构建 “机制可解释、决策可干预、结果可验证” 的下一代疾病模型
Research Background
研究背景
吞噬作用：
清除病原微生物（如细菌、寄生虫）、肿瘤细胞、衰老及凋亡细胞，维持组织稳态。
抗原呈递：
通过MHC分子将抗原片段递呈给T细胞，激活特异性免疫应答。
免疫调节：
分泌细胞因子（如TNF-α、IL家族、IFN-γ）和活性氧/氮物质，调控炎症反应方向。
组织修复与代谢调控：
促进血管生成、组织重塑，参与肌肉再生和代谢疾病调节。
免疫记忆：
通过表观遗传修饰形成训练免疫，增强对重复感染的响应效率。
巨噬细胞的功能
巨噬细胞（Macrophages）是免疫系统中的核心成员，源自骨髓造血干细胞分化的单核细胞，最终迁移至不同组织形成具有组织特异性的亚型。其功能涵盖先天免疫与适应性免疫的双重角色
不同组织中的巨噬细胞具有特定名称与功能，例如中枢神经系统的小胶质细胞、骨骼中的破骨细胞，以及肝脏的库普弗细胞。
组织中的巨噬细胞发育是通过单核细胞在稳定状态下或炎症时迁移到组织中实现的，随后分化为持续性的组织特异巨噬细胞，包括骨巨噬细胞（破骨细胞）、中枢神经系统（小胶质细胞）、结缔组织（组织细胞）和肝脏（库普弗细胞），以及肺泡巨噬细胞（噬尘细胞）、肠、脾和腹膜。
小胶质细胞和库普弗细胞能够在存在白细胞介素34 （IL-34）的情况下自我更新，IL-34表达于这些组织，并与巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的受体结合。由于它们分布和作用于多种不同组织和器官中，因此巨噬细胞具有多种形态和表型。
巨噬细胞的发育
驻留在组织中的巨噬细胞可以从循环单核细胞中分化出来，循环单核细胞由骨髓中的造血干细胞发育而来，也可以在胚胎发育过程中在胎肝、卵黄囊或背主动脉附近的胚胎区域生成，因此在成年期独立于单核细胞而存在。
巨噬细胞是除粒细胞（嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）和树突状细胞（DC）之外的三种吞噬细胞类型之一。
微生物一旦进入宿主并开始复制，这些吞噬细胞中的一种就会将其识别并吞噬破坏，这一过程称为吞噬作用。
大多数病原体通过呼吸系统、肠粘膜、皮肤损伤或泌尿生殖道进入宿主。由于巨噬细胞聚集在粘膜下层组织中，它们通常是第一个遇到病原体的防御细胞。当某些吞噬细胞受体（通常是病原体特有的碳水化合物或脂质结构）与病原体表面相互作用时，吞噬作用就开始了。
在第一次相互作用后，吞噬细胞质膜将病原体包围并内化在一个被称为吞噬体的大膜包裹的内吞囊泡中。然后吞噬体与一个或多个溶酶体融合，形成吞噬溶酶体，溶酶体是含有抗菌肽和酶的小囊泡。溶酶体内容物被释放到吞噬溶酶体中，吞噬溶酶体反过来经历酸化和酶促过程，生成高活性的一氧化氮和超氧化物自由基来杀死病原体。
关于吞噬细胞受体的两个例子是Dectin-1和甘露糖受体(CD206)。两者都是C型凝集素样家族的成员。Dectin-1由巨噬细胞和中性粒细胞表达，并与真菌细胞壁中常见的葡萄糖聚合物结合。CD206由巨噬细胞和DC表达，并与真菌、细菌和病毒共有的多种甘露糖基化配体结合。
巨噬细胞是吞噬细胞
巨噬细胞分类与分型
巨噬细胞的分类是一个非常有争议的话题。
不同的因素会导致不同的表型和巨噬细胞活化状态，包括信号分子、生长因子、转录因子、表观遗传和转录后机制和变化，以及小生境信号，如细胞因子、细胞间接触物和代谢物。此外，面对微生物及其产物，如脂多糖，巨噬细胞可以调节自身的活化状态。然而，巨噬细胞的活化在组织稳态以及炎症和疾病进展中起着至关重要的作用。
一般来说，巨噬细胞可以根据其功能和活化作用进行分类，并分为两种亚型：经典活化的M1巨噬细胞和替代活化的M2巨噬细胞。
Research Hotspots
研究热点
近几年来关于巨噬细胞相关研究的高分论文不段涌现
以关键词“macrophages”在pubmed 中搜索
仅 2022-2024 三年期间就有近6万篇发表的文章
巨噬细胞的功能与调控机制
研究巨噬细胞的分化、激活、功能及其调控机制，包括信号传导通路（如NF-κB、JAK-STAT、MAPK等）以及巨噬细胞与其他免疫细胞的相互作用。
- NF-κB、JAK-STAT、MAPK等通路在巨噬细胞激活中的交叉调控。
- 炎性小体（如NLRP3、AIM2）介导的IL-1β释放机制与自身免疫病关联。
巨噬细胞极化与转分化
研究巨噬细胞在不同刺激下的M1型促炎和M2型抗炎极化状态，以及其在疾病进展中的转分化机制。这些研究对炎症反应、组织修复和肿瘤微环境中的作用至关重要。
- M1型（促炎）与M2型（抗炎）的动态转换机制及其在炎症性疾病（如糖尿病、动脉粥样硬化）和肿瘤微环境中的作用。
- 混合极化状态的发现挑战传统分类，推动基于单细胞测序的亚群细分。
巨噬细胞在免疫和炎症过程中的作用
探讨巨噬细胞在免疫调节（如免疫抑制、免疫刺激）、抗肿瘤免疫以及病原微生物清除中的关键角色。
巨噬细胞与组织修复
研究巨噬细胞在创伤修复、组织再生和疾病恢复过程中的调节作用，特别是在心血管疾病、慢性炎症和肿瘤微环境中的功能。
- 巨噬细胞在创伤愈合中清除坏死细胞，分泌PDGF、TGF-β促进纤维化与基质重塑。
- 工程化巨噬细胞在心肌修复中的应用，例如通过M2-EVs重编程中性粒细胞增强修复能力。
肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）
TAMs在肿瘤微环境中的促肿瘤和抗肿瘤作用是研究热点，科学家们致力于调控TAMs的表型以改善癌症治疗效果。
- TAMs通过分泌VEGF、IL-10等促进肿瘤血管生成和免疫抑制，成为癌症治疗靶点。
- 靶向策略包括阻断CCL2/CCR2招募通路、调控极化（如CSF-1R抑制剂）及CAR-M细胞疗法。
代谢重编程与信号通路
研究巨噬细胞的代谢重编程及其在疾病中的作用，例如如何通过靶向代谢途径调控巨噬细胞的功能。
巨噬细胞在特定疾病中的作用
包括肥胖、糖尿病、哮喘、纤维化、自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎）等慢性疾病的机制研究。
神经退行性疾病
- 小胶质细胞清除β淀粉样蛋白的机制障碍与阿尔茨海默病进展相关。
- 炎症因子过度释放加剧神经元损伤，成为潜在治疗靶点。
跨学科研究与新技术应用
结合分子生物学、免疫学、人工智能等多学科交叉技术，探索巨噬细胞的新功能和新应用
Experimental Documentation
实验资料
典型活化态的M1巨噬细胞
虽然传统的M1/M2模型可以用于体外培养和刺激，来探索不同类型的巨噬细胞活化状态，但对组织巨噬细胞复杂网络的新认识清楚地表明，其无法充分描述这些细胞在体内的功能和表型多样性。 因此，我们建议基于多种标志物的表达和功能特征，采用更灵活和更全面的方法来代替过分简化的M1/M2模型。然而，用于定义M1和M2表型的经典标志物仍然在巨噬细胞表征中发挥重要作用。在这里，我们定义了一些传统的标志物，包括诱导型一氧化氮合酶（iNOS，NOS2）、精氨酸酶-1（Arg1）、甘露糖受体（CD206）、RELM-a（FIX1）和CD163，用于表征巨噬细胞。
人M1巨噬细胞标志物。这些标志物可用于区分M1巨噬细胞和其他细胞类型。
种属 | 巨噬细胞亚型 | 标志物 | 标志物类型 |
人 | M1 | IFN-γ | 分泌 |
人 | M1 | IL-1a | 分泌 |
人 | M1 | IL-1b | 分泌 |
人 | M1 | IL-6 | 分泌 |
人 | M1 | IL-12 | 分泌 |
人 | M1 | IL-23 | 分泌 |
人 | M1 | TNF-α | 分泌 |
人 | M1 | CD16 | 表面 |
人 | M1 | CD16/CD32 | 表面 |
人 | M1 | CD32 | 表面 |
人 | M1 | CD64 | 表面 |
人 | M1 | CD68 | 表面 |
人 | M1 | CD80 | 表面 |
人 | M1 | CD86 | 表面 |
人 | M1 | CD369 (Dectin-1) | 表面 |
人 | M1 | Mer (MerTK) | 表面 |
人 | M1 | MHC II | 表面 |
人 | M1 | IRF5 | 细胞内/转录因子 |
人 | M1 | STAT1 | 细胞内/转录因子 |
名词缩写表：CD，分化群；IFN，干扰素；IL，IL，白细胞介素；IRF，干扰素调节因子；MHC，主要组织相容性复合体；NOS，一氧化氮合酶；STAT，信号转换器和转录活化剂；TNF，肿瘤坏死因子。 | |||
小鼠M1巨噬细胞标志物。这些标志物可用于区分M1巨噬细胞和其他细胞类型。
种属 | 巨噬细胞亚型 | 标志物 | 标志物类型 |
小鼠 | M1 | IFN-γ | 分泌 |
小鼠 | M1 | IL-1 | 分泌 |
小鼠 | M1 | IL-6 | 分泌 |
小鼠 | M1 | IL-12 | 分泌 |
小鼠 | M1 | IL-23 | 分泌 |
小鼠 | M1 | TNF-α | 分泌 |
小鼠 | M1 | CD14 | 表面 |
小鼠 | M1 | CD16/CD32 | 表面 |
小鼠 | M1 | CD32 | 表面 |
小鼠 | M1 | CD64 | 表面 |
小鼠 | M1 | CD68 | 表面 |
小鼠 | M1 | CD80 | 表面 |
小鼠 | M1 | CD86 | 表面 |
小鼠 | M1 | CD204 | 表面 |
小鼠 | M1 | CD369 (Dectin-1) | 表面 |
小鼠 | M1 | Ly-6C | 表面 |
小鼠 | M1 | Mer (MerTK) | 表面 |
小鼠 | M1 | MHC II | 表面 |
小鼠 | M1 | IRF5 | 细胞内/转录因子 |
名词缩写表：CD，分化群；IFN，干扰素；IL，白细胞介素；IRF，干扰素调节因子；MHC，主要组织相容性复合体；TNF，肿瘤坏死因子。 | |||
替代活化型M2巨噬细胞
- M2巨噬细胞可由寄生虫或真菌感染、免疫复合物、凋亡细胞、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、IL-13、TGF-b和2型辅助性T细胞因子 （Th2）IL-4、IL-33和IL-25通过Th2细胞替代活化。促进巨噬细胞进入M2状态的潜在信号包括STAT6、IRF4、PPARδ和PPARγ。
- 与经典活化亚型相反，替代活化的亚型表达相反的表达谱：下调IL-12和IL-23，上调IL-10和IL-1RA 。此外，M2巨噬细胞表达较低的炎症细胞因子IL-1、IL-6和TNF-α。M2巨噬细胞在病原体清除、抗炎反应和代谢以及伤口愈合、组织重塑、免疫调节、肿瘤进展和恶性肿瘤中发挥作用。
- M2表型的特点是表达CD206、CD163、CD209、FIZZ1和Ym1/2。一般来说，这种亚型高效表达吞噬作用和清除甘露糖和半乳糖所需的受体，以及能通过精氨酸酶通路增加鸟氨酸和多聚氨基酸的产生。这种类型的巨噬细胞表达的趋化因子有CCL1、CCL17、CCL18、CCL22和CCL24。
M2巨噬细胞亚型
针对巨噬细胞不同的刺激，已知有四种M2亚型：M2a、M2b、M2c和M2d。这些亚型因其细胞表面标志物、分泌的细胞因子和生物功能不同而各不相同。然而，所有M2巨噬细胞亚型都共同表达IL-10。
- M2a巨噬细胞：由IL-4或IL-13活化。IL-4反过来促进甘露糖受体（CD206）的表达。经证实，进一步上调 IL-10、TGF-b、CCL17、CCL18和CCL22能促进细胞生长、组织修复和胞吞作用。
- M2b巨噬细胞：由免疫复合物、Toll样受体（TLR）配体和IL-1b活化。活化后，这种亚型释放促炎和抗炎细胞因子TNF-α、IL-1b、IL-6和IL-10。M2b巨噬细胞在免疫反应和炎症的调节中发挥作用。
- M2c巨噬细胞：由糖皮质激素、IL-10和TGF-b（和灭活的巨噬细胞）活化。这种亚型的特征是高效表达抗炎IL-10、促纤维化因子TGF-b、CCL16、CCL18以及Mer受体酪氨酸激酶（MerTK），其中MerTK能促进凋亡细胞吞噬。
- M2d巨噬细胞：由TLR拮抗剂、IL-6和腺苷活化。腺苷促进IL-10和血管内皮生长因子（VEGF）的表达，这个过程能加剧血管生成和肿瘤进展。
人M2巨噬细胞标志物。这些标志物可用于区分M2巨噬细胞和其他类型的细胞。
物种 | 巨噬细胞类型 | 标志物 | 标志物类型 |
人 | M2 | IDO | 分泌 |
人 | M2 | IL-10 | 分泌 |
人 | M2 | TGF-b | 分泌 |
人 | M2 | CD115 | 表面 |
人 | M2 | CD204 | 表面 |
人 | M2 | CD163 | 表面 |
人 | M2 | CD206 (MMR) | 表面 |
人 | M2 | CD209 (DC-SIGN) | 表面 |
人 | M2 | FceR1 | 表面 |
人 | M2 | VSIG4 | 表面 |
人 | M2 | IRF4 | 胞内/转录因子 |
人 | M2 | STAT6 | 胞内/转录因子 |
名词缩写表：CD，分化群；FceR1，IgE受体I的Fc片段；IDO，吲哚胺-2，3-双加氧酶；IL，白细胞介素；IRF，干扰素调节因子；STAT，信号转导和转录激活因子；TGF，转化生长因子；VSIG4，V-Set免疫球蛋白域蛋白4。 | |||
小鼠M1巨噬细胞标志物。这些标志物可用于区分M1巨噬细胞和其他细胞类型。
种属 | 巨噬细胞亚型 | 标志物 | 标志物类型 |
小鼠 | M1 | IFN-γ | 分泌 |
小鼠 | M1 | IL-1 | 分泌 |
小鼠 | M1 | IL-6 | 分泌 |
小鼠 | M1 | IL-12 | 分泌 |
小鼠 | M1 | IL-23 | 分泌 |
小鼠 | M1 | TNF-α | 分泌 |
小鼠 | M1 | CD14 | 表面 |
小鼠 | M1 | CD16/CD32 | 表面 |
小鼠 | M1 | CD32 | 表面 |
小鼠 | M1 | CD64 | 表面 |
小鼠 | M1 | CD68 | 表面 |
小鼠 | M1 | CD80 | 表面 |
小鼠 | M1 | CD86 | 表面 |
小鼠 | M1 | CD204 | 表面 |
小鼠 | M1 | CD369 (Dectin-1) | 表面 |
小鼠 | M1 | Ly-6C | 表面 |
小鼠 | M1 | Mer (MerTK) | 表面 |
小鼠 | M1 | MHC II | 表面 |
小鼠 | M1 | IRF5 | 细胞内/转录因子 |
名词缩写表：CD，分化群；IFN，干扰素；IL，白细胞介素；IRF，干扰素调节因子；MHC，主要组织相容性复合体；TNF，肿瘤坏死因子。 | |||
巨噬细胞研究方法
可以从全血（PBMC分离、巨噬细胞分析、单核细胞分化成巨噬细胞）或组织或肿瘤（组织或肿瘤样本的单细胞悬液制剂）中分离和分析巨噬细胞。此外，人和小鼠单核细胞系有商业化的产品，包括THP-1细胞（急性单核细胞白血病）、U937细胞（组织细胞淋巴瘤）以及RAW264.7细胞（小鼠白血病单核巨噬细胞）和J774A.1细胞（小鼠BALB/c单核巨噬细胞）。
有多种方法可以分离巨噬细胞，包括磁珠细胞分选、密度梯度分离、激光捕获显微解剖和流式细胞仪分选法（FACS） [18]。分离后，可以通过基因表达分析、功能研究、细胞因子和趋化因子生成的评估以及使用免疫荧光染色、免疫检定、流式细胞仪、免疫印迹或聚合酶链反应的蛋白质表达和细胞表面标志物来分析和表征巨噬细胞功能和表型。请注意，并非每种分析方法均需要分离巨噬细胞。
巨噬细胞分离
- 当分析或处理来自组织或肿瘤的巨噬细胞时，通常制备组织或肿瘤切片或单细胞悬液。组织或肿瘤切片可直接用于免疫组织化学（IHC）染色和分析。为了制备单细胞悬液，需要解剖组织或肿瘤，然后进行酶消化。单细胞悬浮液可以直接用于表面标记物的流式细胞术分析等方法
- 当需要时，可以使用激光捕获显微解剖和流式细胞仪分选法（FACS）或磁珠细胞分选试剂盒分离巨噬细胞。通过流式细胞术(FACS)进行分离时，使用针对细胞表面标记的荧光染料偶联的抗体对细胞亚群进行染色，然后使用细胞分选仪根据定义的分选标准对染色细胞进行分选。使用抗体磁珠细胞分离试剂时，细胞特异性表面标志物的特异性抗体接合在磁珠上，细胞悬液会继续带有磁珠一起孵育。一旦磁珠上抗体与目标细胞的表面标志物结合，再洗去未结合的非目标细胞，就可得到与磁珠结合的目标细胞。
- 此外，可以进一步培养和刺激分离的巨噬细胞。通常，M1巨噬细胞可以通过刺激被重新编程为M2巨噬细胞，反之亦然。巨噬细胞的培养可用于刺激或生成细胞裂解物或细胞培养上清液，其可用于qPCR检测、免疫印迹或各种免疫检测（IA），包括ELISA、基于磁珠的免疫检测（如Invitrogen ProcataPlex多因子试剂盒）和基于PCR的免疫检测（如Invitrogen ProQuantum高灵敏度免疫检测，用于各种细胞因子的定量）。也可以通过检测吞噬作用来研究巨噬细胞功能。
- 当从全血中分析或处理巨噬细胞时，常用步骤是分离单核细胞并且将其分化为巨噬细胞。因此，使用Ficoll Paque通过密度梯度分离从全血中分离PBMC。这种方法利用了全血中不同细胞类型之间的密度差异。随后，使用FACS流式分选或磁珠细胞分选试剂盒从PBMC悬液中分离CD14+单核细胞。
- 另一种经济高效的分离方法是在组织培养塑料器皿中培养PBMC悬浮液，单核细胞优先粘附在其上;使用明胶涂层表面会增加单核细胞数量。
巨噬细胞体外分化
- 有多种刺激/分化技术能在体外获得原代巨噬细胞或极化M1或M2巨噬细胞。如果不需要进一步分离单核细胞，则分离的PBMC可通过与含15%胎牛血清（FCS）的Gibco RPMI 1640培养基一起培养直接生成巨噬细胞。
- 分离的单核细胞可以使用特殊的分化培养基分化成原代巨噬细胞。例如，使用生长因子GM-CSF和M-CSF可以使单核细胞分化成巨噬细胞。可以在RPMI 1640培养基中刺激单核细胞，培养基中添加10% FCS和10ng/mL GM-CSF或10ng/mL持续7天，能导致M1和M2巨噬细胞分化。刺激后，细胞以细长形状粘附于培养皿表面。
- 另外，可以用不同的细胞因子先后刺激单核细胞来获得M1和M2极化巨噬细胞。用含10% FCS的RPMI 1640培养基培养得到的细胞，随后用10ng/mL脂多糖处理24小时和50ng/mL IFN-γ以获得M1巨噬细胞或添加20ng/mL IL-4可获得M2/M2a巨噬细胞。用免疫复合物和IL-1b或LPS处理能促进M2b活化，加入IL-10、TGF-b或糖皮质激素则能促进M2c活化。可以使用免疫组织化学染色或流式细胞仪分析其表面表达的标志物来识别巨噬细胞类型。
巨噬细胞的识别和表征
- 有多种刺激/分化技术能在体外获得原代巨噬细胞或极化M1或M2巨噬细胞。如果不需要进一步分离单核细胞，则分离的PBMC可通过与含15%胎牛血清（FCS）的Gibco RPMI 1640培养基一起培养直接生成巨噬细胞。
- 分离的单核细胞可以使用特殊的分化培养基分化成原代巨噬细胞。例如，使用生长因子GM-CSF和M-CSF可以使单核细胞分化成巨噬细胞。可以在RPMI 1640培养基中刺激单核细胞，培养基中添加10% FCS和10ng/mL GM-CSF或10ng/mL持续7天，能导致M1和M2巨噬细胞分化。刺激后，细胞以细长形状粘附于培养皿表面。
- 另外，可以用不同的细胞因子先后刺激单核细胞来获得M1和M2极化巨噬细胞。用含10% FCS的RPMI 1640培养基培养得到的细胞，随后用10ng/mL脂多糖处理24小时和50ng/mL IFN-γ以获得M1巨噬细胞或添加20ng/mL IL-4可获得M2/M2a巨噬细胞。用免疫复合物和IL-1b或LPS处理能促进M2b活化，加入IL-10、TGF-b或糖皮质激素则能促进M2c活化。可以使用免疫组织化学染色或流式细胞仪分析其表面表达的标志物来识别巨噬细胞类型。
下表列出了可用于识别巨噬细胞（一般表型）及其表征（功能特征）的标志物。标记物的位置(表面或细胞内)对检测这些抗原的方法有影响。
近期已知的细胞标记物列表。列出的标志物可用于区分人和小鼠巨噬细胞。
种属 | 标志物类型 | 标志物 | 标志物的位置 |
人 | 一般表型 | CD11b | 表面 |
CD14 | 表面 | ||
CD15 | 表面 | ||
CD16 | 表面 | ||
CD68 | 胞内 | ||
功能特性 | IDO | 胞内 | |
CD163 | 表面 | ||
CD206 | 胞内 | ||
精氨酸酶-1 | 细胞内 | ||
CD204（MSR-1） | 表面 | ||
CD369（Clec7a，Dectin-1） | 表面 | ||
GPNMB（骨激活素） | 表面 | ||
VSIG4 | 表面 | ||
Marco | 表面 | ||
MerTK | 表面 | ||
骨桥蛋白 | 胞内 | ||
Axl | 表面 | ||
VISTA | 表面 | ||
HLA-DR | 表面 | ||
小鼠 | 一般表型 | CD11b | 表面 |
F4/80 | 表面 | ||
MerTK | 表面 | ||
CD68 | 胞内 | ||
功能特性 | Axl | 表面 | |
CD204 | 表面 | ||
CD369 | 表面 | ||
VISTA | 表面 | ||
CD163 | 表面 | ||
CD206 | 胞内 | ||
GPNMB（骨激活素） | 表面 | ||
VSIG4（CRIg） | 表面 | ||
CXCL13 | 胞内 | ||
IDO | 胞内 | ||
Nos2（iNos） | 表面 | ||
精氨酸酶-1 | 胞内 | ||
LYVE-1 | 表面 | ||
RELM-a | 表面 | ||
Ly-6C | 表面 | ||
名词缩写表：CD，分化簇；CXCL13，C-X-C基序趋化因子13；GPNMB，糖蛋白非转移性黑素瘤蛋白B；HLA，人白细胞抗原；IDO，吲哚胺-2，3-双加氧酶；LYVE-1，淋巴管内皮透明质酸受体1；NOS，一氧化氮合酶；RELMa，抵抗素样分子-α；VSIG4，V-Set免疫球蛋白域蛋白4。 | |||
流式细胞仪如何识别巨噬细胞
虽然传统的M1/M2模型可以用于体外培养和刺激，来探索不同类型的巨噬细胞活化状态，但对组织巨噬细胞复杂网络的新认识清楚地表明，其无法充分描述这些细胞在体内的功能和表型多样性。 因此，我们建议基于多种标志物的表达和功能特征，采用更灵活和更全面的方法来代替过分简化的M1/M2模型。然而，用于定义M1和M2表型的经典标志物仍然在巨噬细胞表征中发挥重要作用。在这里，我们定义了一些传统的标志物，包括诱导型一氧化氮合酶（iNOS，NOS2）、精氨酸酶-1（Arg1）、甘露糖受体（CD206）、RELM-a（FIX1）和CD163，用于表征巨噬细胞。
iNOS和精氨酸酶1：
巨噬细胞（至少在小鼠细胞中）经典激活型和替代活化型的标志物分别为iNOS和Arg1（图4）。iNOS是一种酶，可催化L-精氨酸的NADPH依赖性氧化反应生成L-瓜氨酸和一氧化氮（NO）。一氧化氮是细胞毒性和其他生理功能（例如，血管舒张）的重要介质。iNOS在巨噬细胞中不是组成型表达，其存在能表明此前用促炎细胞因子（如IL-1、TNF-α或IFN-γ）刺激的结果。
Arg1酶将L-精氨酸转化为尿素和L-鸟氨酸。通过降解精氨酸，Arg1占据了iNOS的底物，并且下调一氧化氮生成。IL-4和IL-13强烈诱导巨噬细胞表达Arg1，而不是由抗炎细胞因子（如IL-10或TGF-b）诱导。与iNOS表达相反，在多个组织巨噬细胞群中发现Arg1有表达。例如，大多数小鼠大腹膜巨噬细胞（F4/80 高巨噬细胞）在稳态下呈Arg1阳性。如图4所示，甚至可以在一些受IFN-γ刺激的巨噬细胞中检测到Arg1。因此，Arg1不应被视为M2极化的完全特异性标记，尤其是分析原代未培养细胞时。
用IFN-γ刺激的巨噬细胞主要表达iNOS，小部分亚群表达iNOS和低水平的Arg1。IL-4刺激的巨噬细胞表达Arg1而不表达iNOS。C57BL/6小鼠骨髓衍生巨噬细胞采用LPS和IFN-γ（M1）或IL-4（M2a）处理24小时，随后用Invitrogen F4/80单克隆抗体（克隆BM8）-eFluor 450进行表面染色。然后用iNOS单克隆抗体（克隆CXNFT）-APC和精氨酸酶1单克隆抗体（克隆A1exF5）-PE进行细胞内染色。存活F4/80+细胞。
甘露糖受体（CD206）：
巨噬细胞甘露糖受体，称为CD206或甘露糖受体C类型1（MRC1），介导真菌、细菌、原生动物和病毒抗原的吞噬和内吞摄取，并且在免疫防御及其调节中发挥重要作用。甘露糖受体是替代活化巨噬细胞的原始识别标志物。与Arg1相反，CD206广泛地在替代活化型巨噬细胞中表达，包括用IL-10或糖皮质激素处理的耐受性细胞。有趣的是，TGF-b被证明可以下调CD206的表达。抑制这种受体表达的其他因素包括LPS、IFN-γ和TNF-α。与Arg1相似，CD206组成型表达于多种类型的组织巨噬细胞中，尽管它与Arg1的表达模式不完全重叠。图5中的右组显示了CD206在小（F4/80 lo）和大（F4/80 hi）腹膜巨噬细胞中的组成性表达。
大量小鼠小腹膜巨噬细胞（F4/80 lo）和大腹膜巨噬细胞（F4/80 hi）的组成性表达CD206。用 F4/80单克隆抗体（克隆BM8）-eFluor 450（货号48-4801-82）对小鼠常驻腹膜渗出细胞进行表面染色，然后用大鼠IgG2b同种型对照（克隆eB149/10H5）-APC （左组）或CD206单克隆抗体（克隆MR6F3）-APC（右组）对细胞进行胞内染色。总细胞用于分析；大多数双阴性细胞为B细胞。
RELM-a（FIZZ1）：
RELM-a，也称为抵抗素样α或FIZZ1，是一种由IL-4和IL-13强烈诱导的小细胞因子，参与抵抗寄生虫感染的反应。与Arg1相似，糖皮质激素和IL-10不能诱导RELM-a。尽管如此，这两种常用的M2活化标志物的在体内表达的模式非常不同。例如，在没有刺激的情况下，大多数小腹膜巨噬细胞（F4/80 lo）和少数大腹膜巨噬细胞（F4/80 hi）表达RELM-a。
大多数小腹膜巨噬细胞（F4/80 lo）和极少数大腹膜巨噬细胞（F4/80 hi）自发表达RELM-a。C57BL/6小鼠常驻腹膜渗出细胞用F4/80单克隆抗体（克隆BM8）-eFluor 450进行表面染色。然后用大鼠IgG1同种型对照（克隆eBRG1）-APC（左组）或RELMα单克隆抗体（克隆DS8RELM）-APC（右组）对细胞进行胞内染色。所有腹膜细胞用于分析；大多数双阴性细胞为B细胞。
CD163：
CD163为触珠蛋白和血红蛋白受体。由于CD163的主要功能是促进铁的再循环过程，因此在脾红髓巨噬细胞中可以观察到CD163的最高表达。CD163还可以用于检测某些细菌化合物，并且在组织巨噬细胞的其他亚群中表达，包括Kupffer c细胞、肠固有层巨噬细胞和一部分大腹膜巨噬细胞（图7），尽管表达程度较低。与人CD163不同，小鼠CD163不容易由M2极化细胞因子诱导，故不是鼠科动物M2巨噬细胞的良好标志物。相反，其表达似乎表明了组织特异性巨噬细胞功能（例如，血红蛋白再循环）。
很大一部分大腹膜巨噬细胞（F4/80 hi）和几乎没有小腹膜巨噬细胞（F4/80 lo）组成性表达CD163。BALB/c小鼠脾细胞用F4/80单克隆抗体（克隆BM8）-eFluor 450和大鼠IgG2a同种型对照（克隆eBR2a）-PerCP-eFluor 710（左组）或CD163单克隆抗体（克隆TNKUPJ）-PE（右组）对细胞进行胞内染色。总细胞用于分析。
Typical Case Studies
典型案例
中文标题：调理作用诱导巨噬细胞吞噬无载体胆红素/JPH203纳米粒子以抑制炎症从而治疗骨关节炎
发表期刊
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- ADVANCED SCIENCE
影响因子
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- 影响因子/JCR分区：14.3/Q1
运用技术
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- 活体成像，Micro CT扫描，代谢组学技术，免疫组化，免疫荧光，HE等病理染色，巨噬细胞培养等
